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免疫组化的操作步骤

2024-03-22 [109]

一 免疫组化( LP 法)操作步骤 :


1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复,可在此步后进行


2. 缓冲液洗 3min/2 次。


3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。


4. 缓冲液洗 5min/2 次。


5. 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。


(注:孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清,这一步可以省略。)


6. 缓冲液洗 5min/2 次。


7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)


8. 缓冲液洗 5min/2 次。


9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。


10 .缓冲液洗 5min/2 次。


11 .滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ,在室温下孵育 30 分钟。


(注: HRP Polymer 对光敏感,应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)


12 .缓冲液洗 5min/2 次。


13 .向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen ) , 混匀后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)


14 .自来水充分冲洗 , 复染,脱水 , 透明 , 封片。

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二.免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 :


( 1 )、石蜡切片脱蜡至水。


( 2 )、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。


( 3 )、蒸馏水冲洗, PBS 浸泡 5 分钟 x2 (如需抗原修复,可在此步后进行)。


( 4 )、 5-10% 正常山羊血清( PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 分钟,倾去血清,勿洗。滴加 一抗 工作液, 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。


( 5 )、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。


( 6 )、滴加适量 生wu素标记二抗 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。


( 7 )、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。


( 8 )、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。


( 9 )、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。


( 10 )、显色剂显色 3-15 分钟( DAB 或 NBT/BCIP )


( 11 )、自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。



三. 冰冻切片免疫组化染色步骤:


冰冻切片 4-8um ,室温放置 30 分钟后,入 4 ℃丙酮固定 10分钟,PBS洗,5分钟x3,用过氧化氢孵育5-10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫组化


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